一、实验设计类问题

Q1：如何选择合适的ELISA类型？

解答：

• 双抗体夹心法：适用于大分子抗原（如细胞因子、病毒蛋白）

• 竞争法：适合小分子抗原（如激素、药物）

• 间接法：常用于抗体检测（如血清抗体效价分析）

Q2：样本应如何预处理？

关键步骤：

• 血清/血浆：3000 rpm离心15分钟去除纤维蛋白

• 细胞裂解液：超声破碎后12000×g离心取上清

• 组织样本：推荐加入蛋白酶抑制剂防止降解

二、操作执行类问题

Q3：显色时间如何控制？

推荐方案：

1. 使用计时器精确控制显色时间

2. 阳性对照显色达OD450≈1.0时立即终止

3. 避免强光直射导致底物自发降解

三、结果分析类问题

Q4：标准曲线线性差（R²<0.95）

排查步骤：

1. 检查标准品稀释是否梯度准确

2. 确认酶标仪波长设置正确（双波长建议450nm/630nm）

3. 更换新配制显色液

Q5：复孔差异大（CV>20%）

改进措施：

• 使用多通道移液器垂直加样

• 提前30分钟取出试剂平衡至室温

• 孔板边缘孔改用空白对照

四、数据异常处理指南

异常现象1：整板无信号

可能原因：

• 酶标记物失活 → 更换新鲜试剂

• 漏加TMB底物 → 建立操作核对表

异常现象2：阴性对照显色

解决方案：

1. 确认封闭剂有效性（推荐5% BSA封闭）

2. 检查二抗是否存在非特异性结合

专家提示 ✦

1. 实验前绘制操作流程图明确关键控制点

2. 建立"阳性对照OD值历史记录表"监测系统稳定性

3. 高浓度样本建议进行预实验确定稀释倍数