全部分类
  • 抗体
  • ELISA试剂盒
  • 蛋白相关

首页 > 技术资源文章分类 > 实验操作指南 > 免疫印迹（WB）实验指南

技术资源
技术服务
最新活动
关于我们
售后服务
免疫印迹（WB）实验指南
发布时间：2023-12-07
各位科研小伙伴们，是不是又在为Western Blot实验抓狂？今天这篇推文，就带你解锁WB实验的“防翻车秘籍”，从蛋白提取到结果分析，手把手教你避开那些让人头秃的坑！
首先，我们来回顾下整个 WB 流程：蛋白样本制备 → 电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵育一抗 → 孵育二抗 → 显影 → 分析。如下图所示：
 
 WB实验流程图

 
一、蛋白样本提取制备
  

1、总蛋白提取：

（1）准备溶液
室温融解蛋白裂解液 RIPA，加入蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物 (10X)，使最终浓度为 1X，混匀，立即放置在冰上。

（2）不同样本
  • 贴壁细胞： 4℃ 预冷的PBS洗 2~3 遍，用细胞刮子刮下细胞，或用胰蛋白酶处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
  • 悬浮细胞：用 PBS 洗 2~3 遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
  • 组织样品：剪取适量组织和适量混匀的蛋白裂解液于匀浆器中磨匀 (0.01 g 组织加上 50-100 μL 的蛋白裂解液)，直至看不见组织块；

（3）裂解
细胞样品按 1×106 细胞数加 100 μL 裂解液，冰上裂解 30 min (或冰上裂解 5 min，超声仪冰浴超声 20 s)。组织样品转移匀浆液于 1.5 mL EP 管中，置于冰上裂解 15 min；

（4）抽提
12,000 rpm, 4℃ 离心 10 min，立即吸取上清至一预冷的 1.5 mL EP 管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。

 

2、BCA蛋白浓度测定：

（1）制备好 BSA 标准品，并将 BCA 试剂 A 液: B 液=50:1 配制适量 BCA 工作液，样品用预冷 PBS 进行稀释；

（2）将标准品和样品分别加到 96 孔板中；

（3）各孔加入 BCA 工作液，37 ℃ 孵育 30 min；

（4）酶标仪 562 nm 波长读取各孔 OD 值；

（5）根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。
 

二、电泳

1、制胶（使用预制胶板请忽略此步骤）

(1) 准备玻璃板，确保两块玻璃板下缘水平且均无豁口，安装时内短外长，用手压实玻璃板及垂直槽制胶架。
(2) 倾斜垂直槽制胶架子装入垂直槽制胶固定架，注意为防止胶片变形漏液体，不要过分用力下压，并确保卡好。
(3) 按照每块 5 mL 配制分离胶 (1 mm 厚度)，轻轻混匀后立即铺板；
(4) 铺板后用异丙醇将分离胶液面压平；
(5) 凝固 40 min 后，吸干异丙醇。用 ddH2O 轻轻冲洗并吸干；
(6) 按照每块 1.5 mL 配制浓缩胶，并插上合适大小的梳子，注意操作要迅速且水平，不能产生气泡；
(8) 40 min 浓缩胶凝固后从制胶架上拆下，用 ddH2O 将残留在胶板上的胶清洗干净，并用保鲜膜包裹住，立即使用或 4°C 储存。

 

2、制样

 

加入 4×上样缓冲液混匀，100℃ 放置 10 min，迅速冰浴冷却；

 

3、跑胶

（1）根据 BCA 测定结果，目的蛋白每孔上样量 20 μg-40 μg，内参蛋白每孔上样量 5 μg-10 μg；
（2）电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，80 V，约 30 min；
（3）溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，120 V，至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

 

三、转膜

(1) 准备转膜缓冲液：

提前配制好转移缓冲液并预冷至 4 ℃；

(2) 准备 PVDF 膜和滤纸：

将 PVDF 膜在甲醇中浸泡 30 s (从不透明变为半透明)，接着用 ddH2O冲洗膜表面，最后将膜和滤纸放入转膜缓冲液中; 

(3) 处理凝胶：

轻轻撬开玻璃板，切掉浓缩胶和周围不需要的区域。将凝胶放入转膜缓冲液中，确保胶的完整性; 

(4) 制备转膜“三明治”：

三明治夹套的黑色面向下，透明面 (或红色面) 朝上打开放置在干净的桌面上。从下依次往上放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵。确保每一层之间都没有气泡，可以在放置最上层泡沫垫前使用滚轮轻轻滚动，以去除气泡; 

(5) 转膜：

将夹套插入转移电泳芯中，确保黑色板朝向黑色板。然后将转移电泳芯放入转膜槽中，加入足够的转膜缓冲液，确保夹套完全浸没在缓冲液中。设置转膜电流为恒流，220 mA，根据蛋白大小不同设置转膜时间 (一般 30 kDa 以下转 30 min，30-70 kDa 转 60-90 min，70-150 kd 转 90-180 min); 

(6) 转膜后处理：

 

转膜完成后，取出 PVDF 膜，用 TBST 冲洗膜表面，进行封闭等后续步骤。

 

四、封闭

室温下，将转好的膜于摇床上用 5% 的脱脂牛奶 ，磷酸化蛋白检测用 5% 的 BSA缓冲液，室温封闭 1-2 h。
封闭液的主要作用是占据非目标结合位点，降低背景信号，从而提高检测的特异性和灵敏度。常用的封闭液：脱脂奶粉、牛血清白蛋白。那么封闭液应该如何选择呢？

脱脂奶粉：
  • 一种常用的封闭液，适用于大多数实验条件，并且价格相对便宜。
  • 使用时最好现配现用，确保其最佳效果。
  • 脱脂奶粉含有大量的酪蛋白，在检测磷酸化蛋白时可能会产生高背景，此时应选择其他封闭液。
  • 由于自身含有生物素，也不能用于生物素标记的抗体系统。

牛血清白蛋白(BSA)：
  • 一种常用的封闭液，尤其在检测磷酸化蛋白时表现出色。
  • 成分单一，适用于多数情况，但不可封闭Fc受体。
注:封闭非磷酸化蛋白时，使用脱脂奶粉效果更佳。因为BSA仅含有一种蛋白质，分子量为66KDa。而奶粉则含有多种蛋白质，所以封闭作用更佳。

 

五、抗体孵育

（1）孵育一抗：稀释一抗 (TBST 溶解的 5 % 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA)，4℃ 过夜孵育。
（2）洗膜：按照 3 次 TBST 进行洗膜，每次 5 min。
（3）孵育二抗：一般使用 TBST 溶解的 5% 脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用 TBST 溶解的 5% BSA 室温孵育 1-2 h。
（4）洗膜：按照 3 次 TBST，1 次 TBS 进行洗膜，每次 10 min。

 

抗体孵育温馨提示：

1.为减少非特异结合，可选用封闭液作为一抗和二抗的抗体稀释液。
2.一抗孵育条件推荐4°过夜，二抗孵育条件为室温，1h。
3.洗涤液推荐选用TBST缓冲液。洗涤时应保持适中的摇床速度，避免过快导致膜上的蛋白或抗体脱落，同时确保洗涤液能够充分接触到膜上的每一个角落。在洗涤过程中，适时更换新的洗涤液以确保洗涤效果。
4.洗涤过程中需要保持膜的湿润，避免膜干燥导致抗体结合力下降或蛋白变性

 

六、显影

（1）在避光环境中，将 ECL 化学发光试剂 A 液、B 液 1:1 配置，充分混匀；
（2）将 PVDF 膜置于化学发光成像仪载物台上;
（3）用移液器吸取适量 ECL 混合液滴在 PVDF 膜上，确保工作液均匀覆盖在整张印迹膜上;
（4）推入载物台，设置曝光时间进行图片采集 (可设置不同的曝光时间采集图像，从中选取曝光效果最佳的图像)。